3-10C, AMCF-I, C-X-C motif chemokine 8, CXCL8, CXCL8SCYB8, Emoctakin, GCP1, GCP-1TSG-1, IL8, IL-8, interleukin 8, K60, LAI, LECT, MDNCF, MDNCFb-ENAP, member 8, MONAPGCP1, NAP1, NAP-1NAP1, NCF, Neutrophil-activating protein 1, Protein 3-10C, T cell chemotactic factor, T-cell chemotactic factor, TCF, TSG1

Human IL-8/CXCL8 ELISA Kit采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附檢測技術。特異性抗人IL-8抗體預包被在高親和力的酶標板上。酶標板孔中加入標準品、待測樣本和生wu素化的檢測抗體，經過孵育，樣本中存在的IL-8與固相抗體和檢測抗體結合，形成免疫復合物。洗滌去除未結合的物質后，加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素（Streptavidin-HRP）。洗滌后，加入顯色底物，避光顯色。加入終止液終止反應，在450nm波長（參考校正波長540nm或570nm）測定吸光度值。

Human

31.3pg/mL-2000pg/mL

需自備試驗器材
1. 酶標儀（可測量450nm檢測波長的吸收值及540nm或570nm校正波長的吸收值）
2. 高精度加液器及一次性吸頭
3. 蒸餾水或去離子水
4. 洗瓶（噴瓶）、多通道洗板器或自動洗板機
5. 500mL量筒

一、實驗前準備
1. 樣品收集及儲存
①細胞培養上清：顆粒物應通過離心去除；立刻檢測樣本。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于-20℃冰箱內，避免反復凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
②血清：使用血清分離管（SST）收集樣本，樣品室溫放置30分鐘。離心15分鐘，轉速為1000g。立即取出血清，并立即檢測。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內，避免反復凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
③血漿：使用EDTA、肝素或檸檬酸作為抗凝血劑收集血漿，在收集后30分鐘內離心15分鐘，轉速為1000g，并立即檢測。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內，避免反復凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
2. 試劑配制（使用前請將所有試劑和樣本放置于室溫，靜置 15 分鐘。建議所有的實驗樣本和標準品做復孔檢測）
①1×洗滌液配制：試劑盒中的濃縮洗滌液為20×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋為1×工作液。例：取10mL濃縮洗滌液+190mL蒸餾水定容至200mL，實際操作時可先計算使用量，再進行配制。
②1×稀釋用緩沖液配制：試劑盒中的濃縮稀釋用緩沖液為10×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋至1×工作液。例：取3mL濃縮稀釋用緩沖液+27mL蒸餾水定容至30mL。實際操作時可先依據樣本稀釋倍數，計算所需的稀釋用緩沖液用量，再進行配制。
③檢測抗體：將干粉離心至管底，使用110uL稀釋用緩沖液（1×）溶解，室溫靜置5分鐘后得到100×母液；使用前需稀釋為1×工作液。按照每孔用量100uL計算所需體積。例：使用了10個孔，則取10uL的100倍工作濃度的檢測抗體，使用稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作濃度的檢測抗體。
④SA-HRP：SA-HRP為40×母液，使用前需使用稀釋緩沖液（1×）稀釋配制成1×工作液，每孔所需量為100uL。例：使用了10個孔，則取25uL的40×母液+975uL稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作濃度的檢測抗體。
⑤顯色液：按每孔100uL，計算當次試驗所需要用量，取出相應體積的顯色液，避光；取出的顯色液僅供當日使用。
⑥標準品：凍干標準品用稀釋用緩沖液（1×）重溶，重溶體積1000uL，得到濃度為2000pg/mL標準品母液。輕輕震搖至少5分鐘，其充分溶解。每個稀釋管中加入300uL稀釋用緩沖液（1×）。將標準品母液參照下圖做系列稀釋，每管須充分混勻后再移液到下一管。沒有稀釋的標準品母液可用作標準曲線最高點（2000pg/mL），稀釋用緩沖液（1×）可用作標準曲線零點（0pg/mL）。
二、操作步驟
1. 準備好所有需要的試劑和標準品；
2. 從已平衡至室溫的密封袋中取出微孔板，未用的板條請放回鋁箔袋內，重新封口；
3. 向微孔板中加入300uL洗滌液，靜置浸泡30秒，棄掉洗液在吸水紙上將微孔板拍干，請立即使用不要讓微孔板干燥；
4. 分別將不同濃度標準品，實驗樣本或者質控品加入相應孔中，每孔100uL。用封板膠紙封住反應孔，室溫孵育2小時;
5. 將板內液體吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自動洗板機洗板。每孔加洗滌液300uL，然后將板內洗滌液吸去。重復操作3次。每次洗板盡量吸去殘留液體會有助于得到好的實驗結果。最后一次洗板結束，請將板內所有液體吸干或將板倒置，在吸水紙拍干所有殘留液體；
6. 在每個微孔內加入100uL檢測抗體。用封板膠紙封住反應孔，室溫孵育2小時；
7. 重復第5步洗板操作；
8. 在每個微孔內加入100uLSA-HRP，室溫孵育20分鐘。注意避光；
9. 重復第5步洗板操作；
10. 在每個微孔內加入100uL顯色液，室溫孵育5-30分鐘，注意避光；
11. 在每個微孔內加入50uL終止液，孔內溶液顏色會從藍色變為黃色。如果溶液顏色變為綠色或者顏色變化不一致，請輕拍微孔板，使溶液混合均勻；
12. 加入終止液后30分鐘內，使用酶標儀測量450nm的吸光度值，設定540nm或570nm作為校正波長。如果沒有使用雙波長校正，結果準確度可能會受影響；
13. 計算結果：將每個標準品和樣品的校正吸光度值(OD450-OD540或OD570)、復孔讀數取平均值，然后減去平均零標準品OD值。使用計算機軟件作四參數邏輯(4-PL)曲線擬合創建標準曲線。另一種方法是，可以通過繪制標準品濃度做對數與相應OD值對數生成曲線，并通過回歸分析確定優良擬合線。這個過程可生成一個足夠使用但不太精確的數據擬合。若樣本經過稀釋，計算濃度時應乘以稀釋倍數。
注：提供的標準曲線數據僅供參考，應根據同次試驗所繪標準曲線計算樣本含量。

三、試劑盒參數
1. 回收率：在細胞培養基樣本中摻入不同水平的人IL-8/CXCL8，測定其回收率。回收率范圍在96-118%，平均回收率在108%。
2. 靈敏度：人IL-8/CXCL8的zui低可測劑量（MDD）一般小于7.8pg/mL。zui低可測值是根據20個標準曲線零點吸光值的平均值加兩倍標準差計算得到的相對應濃度。
3. 校正：此ELISA試劑盒經大腸桿菌表達的高純度重組人IL-8/CXCL8蛋白所校正。
4. 線性：4個不同的樣本中摻入高濃度的人IL-8/CXCL8，然后用稀釋劑（1×）將樣本稀釋到檢測范圍內，測定其線性。
5. 特異性：此ELISA法可檢測天然及重組人IL-8/CXCL8蛋白。將以下因子用稀釋劑（1×）配制成 50ng/mL的濃度來檢測與人IL-8/CXCL8的交叉反應。將50ng/mL的干擾因子摻入中間范圍的重組人IL-8/CXCL8對照品中，來檢測對人IL-8/CXCL8的干擾。沒有觀察到明顯的交叉反應或干擾。



四、常見問題解析
1. 白板（顯色完成后，無顏色出現）
2. 花板（空白、陰性陽性對照正常，但標本孔OD值明顯偏高）

五、實驗流程圖

白細胞介素-8（IL-8，也稱GCP-1、NAP-1和CXCL8）是屬于α型或CXC家族的8-9kDa的趨化因子，可與肝素結合。目前為止，共發現了15種人的CXC家族蛋白，大小在8-12kDa之間。絕大多數位于人類4號染色體，都具有典型的三β折疊層/一個α螺旋結構，多數在N端顯示Glu-Leu-Arg三肽基序。人IL-8先合成為一個99氨基酸前體，其中包含一個20氨基酸的信號序列，和一個79個氨基酸的成熟區域。它可作為單體、同源二聚體、及與CXCL4/PF4形成的異源二聚體在體內循環。IL-8單體被認為是zuiju有生物活性的，而異源二聚體可能會增強PF4的活性。在氨基酸水平，成熟的人IL-8與豬和犬分別有65%和70%的同源性。在嚙齒動物中，IL-8的相應基因尚未發現。通過選擇性剪接和差別蛋白水解產生了多種IL-8亞型。選擇性剪接發生在C-端，那里有一個11個氨基酸替代（位置在aa#92-99)。蛋白酶水解作用可能是一個細胞的特定事件，它在IL-8的N-端產生截斷。例如，成纖維細胞和血管內皮細胞將第21和第22氨基酸切斷，形成IL-8，而單體細胞和淋巴細胞在第21-25氨基酸切割，產生IL-8。這些短式IL-8一般來說具有更高的生物活性，尤其是針對CXCR1IL-8受體的活性增高。大約15%的IL-8在前體Arg27位發生了瓜氨酸化，這可提高IL-8的半衰期和促使白血球增多。很多類型的細胞都分泌IL-8，其中包括單核細胞和中性粒細胞、成纖維細胞和角質形成細胞、肥大細胞、內臟平滑肌細胞、樹突狀細胞、II型大肺泡細胞和內皮細胞。
IL-8受體有兩個，都屬于G蛋白耦聯受體蛋白：CXCR1/IL-8RA和CXCR2/IL-8RB，二者之間的氨基酸序列享有77%同源性。CXCR1分子量為45-50kDa，幾乎wan全由IL-8獨享；CXCR2分子量為35-40kDa，由所有的CXC趨化因子所共有。CXCR1和CXCR2分別形成組成型同源二聚體，這似乎是它們的功能性構型。當同一個細胞表達時，異源二聚體也會形成；但當它與IL-8結合后便會被解體。CXCR2對低濃度IL-8有響應，且主要與趨化和MMP-9釋放有關。與此相反，CXCR1對高濃度IL-8有響應，并與呼吸爆發及磷脂酶D2的激活有關。因此，在中性粒細胞CXCR2被認為可引導中性粒細胞遷移到炎癥部位，然后引發CXCR1介導的抗菌活性。
IL-8最著名的功能是它在免疫細胞中的促炎作用。從本質上講，IL-8是由暴露于炎性刺激因子的多種細胞類型分泌。對于單核細胞/巨噬細胞來說，微生物的暴露引起IL-8的釋放；隨后，CXCR2介導的趨化作用將中性粒細胞遷移到抗原攻擊的部位，并伴隨下一步抗菌活性的激活及啟動。IL-8可增強骨髓M-CSF的作用，從而引起粒細胞的成熟和釋放。IL-8的這兩個功能相輔相成。有報道說，IL-8對腫瘤相關的內皮細胞具有血管生成功能。此時，腫瘤源性的IL-8可以采取一種旁分泌方式激活血管內皮細胞的CXCR1和CXCR2。CXCR1和CXCR2都與PI3-K/Akt和RasGTP信號通路相關，參與細胞的存活和增殖。此外，IL-8正調節VEGFR2和EGFR屬于介導細胞生長和遷移的受體絡氨酸激酶。

Human

未開封試劑盒，2-8℃儲存。

1. 請在Human IL-8/CXCL8 ELISA Kit有效期內使用。
2. 不同試劑盒及不同批號試劑盒的組分不能混用。
3. 樣本值若大于標準曲線的最高值，應將樣本用稀釋劑（1×）稀釋后重新檢測；若細胞培養上清液樣本需分布稀釋，除最后一步用稀釋劑稀釋外，其它中間稀釋可采用細胞培養基。
4. 檢測結果的不同可由多種因素引起，包括實驗人員的操作、移液器的使用方式、洗板技術、反應時間或溫度、試劑盒的儲存等。
5. 試劑盒中的終止液是酸性溶液，使用時請做好眼鏡、手、面部及衣服的防護。
6. 僅供科研使用，不可用于體外診斷。