5mg/mL

一、細胞培養器皿的表面包被：
組織培養器皿的表面包被推薦濃度為1-5μg/cm2，起始濃度可shou選5μg/cm2。建議根據具體細胞類型來優化。
1、6mM HAc 稀釋液的制備
本品以溶于6mM HAc（=0.36g/L HAc）的無菌溶液形式提供，本身不溶于中性pH，建議用6mM HAc 溶液做進一步稀釋。
配制方法：取34.5μL 冰醋酸（17.4 M）加入100ml 雙蒸水，充分混勻后即得到6mM HAc 溶液，0.22μm 濾膜過濾除菌后待用。
2、包被步驟
（1）根據自身實驗體系以及優化后的包被濃度來計算所需的膠原蛋白量，并加入相應孔內，確保膠原蛋白溶液wan全覆蓋表面。
①以包被濃度為5μg/cm2，先用6mM HAc 稀釋液將膠原蛋白（5mg/mL）稀釋到合適的中間濃度，50μg/mL，然后參考表1 不同培養皿內膠原蛋白加量表 來加量到各孔內；
②以包被濃度為2μg/cm2，先用6mM HAc 稀釋液將膠原蛋白（5mg/mL）稀釋到合適的中間濃度，12μg/mL，然后參考表1 不同培養皿內膠原蛋白加量表來加量到各孔內；
                                                   表1 不同培養皿內膠原蛋白加量表
（2）室溫孵育1h，小心吸掉多余液體，用無菌PBS 清洗3~4 次后直接使用。或者加完膠原蛋白溶液后，在超凈臺內開蓋過夜晾干。無菌條件下，包被好的器皿在4-25℃至少可保存3 個月。
二、三維膠原的制備：
當鼠尾膠原蛋白I 使用濃度>1mg/mL，pH 7.0 左右皆可形成具有一定強度的三維膠，建議成膠濃度為1-2mg/mL。
由于本品是以溶于6mM HAc 的無菌溶液形式提供，在成膠過程需先加入0.06 倍體積的0.1M NaOH 中和。
1、需要溶液準備（無菌、預冷）
10×PBS（可含酚紅）或10×細胞培養液
0.1M NaOH
雙蒸水
2、三維膠原制備（不含細胞）（以配制1mL，1mg/mL 三維膠為例）：
（1）取200μL 膠原蛋白（5mg/mL）加到置于冰浴的離心管內，加入690μL 無菌水。之后加到12μL 0.1M NaOH【注意：該步驟不能反，如果反過來把12μL 0.1M NaOH 加到膠原溶液中，會由于NaOH 不能迅速混勻而產生局部的膠原凝結】，立即混勻。再加入100μL 10×PBS 或10×細胞培養液，混勻后立即加到培養器皿中【注意：混勻后pH 為7.0 左右，如果PBS 或培養液中沒有加酚紅，初次使用時需要用pH 試紙測試】
（2）將培養器皿在室溫（25℃左右）放置20min 待膠凝固后，轉移到培養箱內?！咀⒁狻浚喝绻渲浦惺褂玫氖?0×PBS，需要在做細胞培養前，先加入適當體積的細胞培養液預平衡。
3、三維膠原制備（含細胞）（以配制1mL，1mg/mL 三維膠為例）：
（1）準備好細胞懸液，并放置于冰浴中。
（2）將200μL 膠原蛋白（5mg/mL）加到12μL 0.1M NaOH【注意：該步驟不能反，如果反過來把12μL0.1M NaOH加到膠原溶液中，會由于NaOH 不能迅速混勻而產生局部的膠原凝結】，立即混勻。再加入23μL 10×PBS
或者10×細胞培養液，立即混勻【注意：混勻后pH 為7.0 左右，如果PBS 或培養液中沒有加酚紅，初次使用時需要用pH試紙測試】。再加入760μL 的細胞懸浮液，混勻后立即加到培養器皿中。
（3）將培養器皿在室溫（25℃左右）放置20min 待膠凝固后，加入適當體積細胞培養液，轉移到培養箱中培養。

2-8℃保存，不可凍存，有效期12個月。

1、整個操作請于冰上進行，因室溫鼠尾膠原I 可迅速成膠，操作過程盡量保持低溫。
2、整個操作請在無菌環境下無菌操作，避免污染以影響細胞生長。
3、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

溶液