分選原理

選用生物素（biotin）標記的單克隆抗體對非目標細胞（非 CD3+ T 細胞）進行標記，然后通過鏈霉親和素（streptavidin）標記的磁珠對非目標細胞進行清除，從而達到人外周血 CD3+ T 細胞分選的目的。分選過程需要用到磁力架。

分選試劑及儀器

人CD3+T細胞分選試劑盒（陰選法）(abs50126)

產品組成：

細胞磁性分離器（多功能）(abs90335）

分選方法

1、制備人 PBMC：利用 Ficoll 密度梯度離心法從人外周血中分離 PBMC，收集 PBMC，以 PBS 洗滌細胞，離心后將 PBMC重懸于分選 buffer中，調整細胞密度為 1×10⁸ cells/mL。
注意：分選 buffer 為含有 2 mM EDTA 和 2% 胎牛血清（FBS）的 PBS 或者含有 2 mM EDTA 和 5% BSA 的 PBS，需預先通過 0.22 μm 濾膜過濾除菌。

2、將 100 μL 細胞懸液（1×10⁷個細胞）加入無菌流式管底部，再加入 2 μL Biotin-Antibody Mix，混勻后4°C 孵育 10 min。
注意：將細胞懸液直接加入流式管底部，避免沿流式管管壁加入。根據所使用磁力架不同也可使用離心管進行細胞分選。如果分選更多細胞，則按比例增加 Biotin-Antibody Mix 的用量。

3、孵育完成后，在流式管中加入 20 μL 清洗過的 Streptavidin，混勻后 4°C 孵育 10 min（磁珠使用前需要用分選 buffer 進行清洗：渦旋振蕩徹di重懸磁珠，取實驗需要的磁珠至 1.5 mL 離心管，加入分選 buffer 至總體積為 1 mL，10000 g，離心 1 min，棄上清。加入 1 mL 分選 buffer 重懸磁珠，10000 g，離心 1 min，棄上清。用與起初相同體積的分選 buffer 重懸磁珠。如取 20 μL 磁珠進行清洗，則清洗后用 20 μL 分選 buffer 進行重懸）。
注意：如果分選更多細胞，則按比例增加 Streptavidin 用量。例如分選 5×10⁷ 個細胞，在 500 μL 細胞懸液中加入 10 μL Biotin-Antibody Mix 和 100 μL treptavidin。如果分選少于 1×10⁷個細胞，則將細胞懸液體積補至 100 μL，加入 2 μL Biotin-Antibody Mix 和 20 μL Streptavidin。

4、孵育完成后，在流式管中加入 2.5 mL 分選 buffer，用移液器吹打 5 次混勻（避免劇烈振蕩或者上下顛倒混勻）。

5、將含有細胞的流式管置于磁力架上，靜置 5 min。

6、將細胞懸液輕柔倒入一個無菌離心管中（傾倒過程中流式管不要脫離磁力架），此細胞懸液中即包含純化的人 CD3+ T 細胞。300 g，離心 5 min。棄上清，收集細胞。

7、根據實驗需要洗滌細胞后，將細胞重懸于所需緩沖液或培養基中，進行培養。

從人PBMC中分選CD3+ T細胞，用PE標記的 anti-human CD3抗體（克隆號OKT3）染色后進行流式細胞分析. 結論：分選前后的CD3+ T細胞純度分別為69.1%和97.9%。

培養原理

人 CD3/CD28 T 細胞激活磁珠可以簡單快捷的活化及擴增T 細胞，無需飼養層細胞（抗原遞呈細胞）或抗原。磁珠為直徑 5 µm 的惰性超順磁珠，大小與抗原呈遞細胞相似，同時共價偶聯抗CD3 和抗CD28 抗體。細胞培養過程中可使用重組人 IL-2 刺激 T 細胞群擴增?；罨驍U增后，磁珠可以通過磁力架輕松去除。

培養步驟

一、試劑配置
1、清洗 buffer：含有 2 mM EDTA 和 2% 胎牛血清（FBS）的 PBS 或者含有 2 mM EDTA 和 5% BSA的 PBS，需預先通過 0.22 μm 濾膜過濾除菌。
2、免疫細胞無血清培養基(abs9772)；
3、IL-2(abs04045)；
4、CD3/CD28磁珠(abs160032)；
5、青霉素-鏈霉素溶液(100×,雙抗)（abs9244）

二、操作步驟
1、清洗磁珠
（1）徹di重懸試管中的磁珠（如渦旋>30秒，或置于旋轉儀5分鐘）。
（2） 吸取目標體積的磁珠至流式管中，加入同等體積的清洗Buffer。若不足1mL，添加1mL的清洗Buffer，渦旋5秒，或使用移液器吹打混勻，注意避免產生氣泡（此處也可直接使用細胞培養基清洗）。
（3）將流式管置于磁力架上3分鐘，棄上清。
（4）重復步驟2-3，本次使用細胞培養基對磁珠再次清洗。共清洗磁珠兩次。
（5） 使用細胞培養基重懸磁珠（比如：吸取 25 μL 磁珠進行清洗，清洗后用 1 mL 細胞培養基進行重懸）。

注意事項
取用激活磁珠前徹di重懸磁珠（如渦旋>30秒，或置于旋轉儀5分鐘），吹打時避免產生氣泡。進行流式檢測前，使用磁力架去除磁珠（包括結合在細胞上的磁珠，可以通過輕柔吹打釋放磁珠），此時細胞位于上清液中。收集上清液，進行下一步的流式檢測。

2、人 T 細胞的擴增
（1）調整CD3+ T細胞種板濃度為1-1.5 x 10⁶ cells/mL，按照磁珠與細胞比例1：1加入激活磁珠。
（2）激活 2天后，向培養基中添加 300 U/mL 的重組人 IL-2。
（3）細胞與磁珠放于 37℃，5% CO₂培養箱中孵育，根據實驗需要決定細胞的培養時長。
 (4)  每日查看細胞激活與擴增情況，注意細胞的大小和形狀。當細胞皺縮或增殖速度明顯放慢時，提示細胞可能耗竭。
（5）推薦在細胞激活的前 2天時不要處理細胞，2 天后隨時觀察細胞狀態，當培養基變黃或孔內細胞數目過多時換液或傳代。每次換液或傳代后，應及時補充重組人 IL-2 至 300 U/mL。
（6）定期進行細胞計數，當細胞密度超過 5x 10⁶ cells/mL 時，輕柔吹打混勻，將細胞密度調整為 0.5-1 x 10⁶ cells/mL。

剛接種的 T 細胞（棕色為抗體歐聯磁珠）	T 細胞-day5-細胞增殖明顯（T細胞團）

	使用人CD3/CD28 T細胞激活磁珠，刺激CD3+ T細胞24到48小時，細胞用FITC anti-human CD69抗體（克隆號FN50 ）和PE anti-human CD25抗體（克隆號BC96）標記，進行流式細胞儀分析。 結論：刺激前后CD25+ CD69+ T細胞占總細胞的比例分別為0.70% 和75.81%
活化人T細胞的PD-1表達。人T細胞用抗人CD3/CD28磁珠刺激，并擴增14天

今天講解就到這了，大家如有實驗問題，歡迎入群交流哦！

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