分選原理

選用不同的生物素（biotin）標記單克隆抗體對非目的細胞（非 CD8+T 細胞）進行標記，而后通過鏈霉親和素（streptavidin）標記的磁珠對非目標細胞進行清除，從而達到小鼠 CD8+ T 細胞分選的目的。分選過程需要用到磁吸分離器。

分選試劑及儀器

小鼠CD8+T細胞分選試劑盒（陰選法）(abs50129)

產品組成：

細胞磁性分離器（多功能）(abs90335）

分選方法
1、制備單細胞懸液：在 70 μm 細胞篩網上研磨脾臟，以預冷的 PBS 沖洗細胞篩網，收集細胞懸液于50mL 離心管中，500 g，離心 5 min。

2、離心結束，棄上清，加入 5 mL 紅細胞裂解液（ACK），室溫裂解 5 min，再加入 20 mL PBS，500 g，離心 5 min。
注意：紅細胞裂解步驟可根據所用裂解液不同調整用量及時間。少量紅細胞殘留不會影響后續分選及細胞純度。

3、離心完成后，棄上清，將脾細胞重懸于 PBS，細胞懸液用 70 μm 細胞篩網過濾后，計數。計數完成后，500 g，離心 5 min。
注意：細胞懸液需要過細胞篩網，以除去組織和細胞團塊，否則會影響后續細胞分選純度。

4、離心完成后，棄上清，將細胞重懸于分選 buffer 中，調整細胞密度為 1×10⁸ cells/mL。
注意：分選 buffer 為含有 2 mM EDTA 和 2% 胎牛血清（FBS）的 PBS 或者含有 2 mM EDTA 和 0.5% BSA的 PBS，需預先通過 0.22 μm 濾膜過濾除菌。

5、將 100 μL 細胞懸液（1×10⁷個細胞）加入無菌流式管底部，再加入 2 μL Biotin-Antibody Mix，混勻后4°C 孵育 10 min。
注意：加入細胞懸液時將細胞加入流式管底部，避免沿流式管管壁加入。根據所使用磁力架不同也可使用離心管進行細胞分選。如果分選更多細胞，則按比例增加 Biotin-Antibody Mix 的用量。

6、孵育完成后，在流式管中加入 20 μL 清洗過的 Streptavidin（磁珠使用前需要用分選 buffer 進行清洗：渦旋振蕩重懸磁珠，吸取實驗需要的磁珠至 1.5 mL 離心管，加入 1mL 分選 buffer，10000 g 離心 1 min，棄上清。加入 1 mL 分選 buffer 重復洗滌磁珠 1 次后用與原來相同體積的分選 buffer 重懸磁珠。如吸取 20 μL 磁珠進行清洗，則清洗后用 20 μL 分選 buffer 進行重懸），混勻后 4°C孵育 10min。
注意：如果分選更多細胞，則按比例增加 Streptavidin 用量。例如分選 5×10⁷ 個細胞，在 500 μL 細胞懸液中加入 10 μL Biotin-Antibody Mix 和 100 μL Streptavidin。如果分選少于 1×10⁷ 個細胞，則將細胞懸液體積補至 100 μL，使用 2 μL Biotin-Antibody Mix 和 20 μL Streptavidin。

7、孵育完成后，在流式管加入 2.5 mL 分選 buffer，用移液器上下混合吹打 5 次混勻（避免劇烈振蕩或者上下顛倒混勻）。

8、將含有細胞的分選流式管置于磁力架上，靜置 5 min。

9、將細胞懸液輕柔倒入一個無菌離心管中（傾倒過程中流式管不要脫離磁力架），此細胞懸液中即包含純化的小鼠 CD8+ T 細胞，500 g，離心 5 min。離心后棄上清，收集細胞。

10、根據實驗需要洗滌細胞后，將細胞重懸于所需緩沖液或培養基中，即可用于后續分子生物學或細胞生物學實驗。

分選效果：
從 C57BL/6 小鼠脾臟細胞中分選 CD8+ T 細胞，分選前后的細胞用 FITC anti-mouse CD8 抗體（克隆號 53-6.7）標記后進行流式細胞儀分析，分選前后的 CD8+ T 細胞純度分別為 13.8%和 97.1%。

從C57BL/6小鼠脾臟細胞中分選CD8+T細胞，用FITC標記的 anti-mouse CD8抗體（克隆號53-5.8）染色后進行流式細胞分析。 結論：分選前后的CD8+細胞純度分別為8.9%和95.1%

培養原理

如果不需要對分選后的選CD8+T進行大規模擴增，可選用小鼠脾臟CD8+T細胞專用維持培養基（abs90125）進行維持培養，能維持細胞3-5天的代謝活性。

如果需要對分選后的選CD8+T進行大規模擴增，需要下面的擴增體系：

小鼠脾臟CD8+T細胞專用維持培養基（abs90125）+Anti-Mouse CD3/CD28 Monoclonal Antibody Beads（Activation）（abs160030）

磁珠可以簡單快捷的活化及擴增T 細胞，無需飼養層細胞（抗原遞呈細胞）或抗原。磁珠為直徑 5 µm 的惰性超順磁珠，大小與抗原呈遞細胞相似，同時共價偶聯抗CD3 和抗CD28 抗體。活化或擴增后，磁珠可以通過磁力架輕松去除。

培養步驟

一、試劑配置
1、清洗 buffer：含有 2 mM EDTA 和 2% 胎牛血清（FBS）的 PBS 或者含有 2 mM EDTA 和 0.5% BSA 的PBS，需預先通過 0.22 μm 濾膜過濾除菌。
2、小鼠脾臟CD8+T細胞專用維持培養基（abs90125）；

3、Anti-Mouse CD3/CD28 Monoclonal Antibody Beads（Activation）（abs160030）；

注意：取用 T細胞激活磁珠前徹di重懸磁珠（如渦旋>30 秒，或置于旋轉儀 5 分鐘），吹打時避免產生氣泡。進行流式檢測前，使用磁力架去除磁珠（可以通過輕柔吹打釋放結合在細胞上的磁珠），收集上清液，進行下一步的流式檢測。

二、操作步驟
1、清洗磁珠：
（1）徹di重懸試管中的磁珠（如渦旋>30 秒，或置于旋轉儀 5 分鐘）。
（2）吸取目標體積的磁珠至流式管中，加入同等體積的清洗 Buffer。若使用的磁珠體積不足 1 mL，添加 1 mL的清洗 Buffer，渦旋 5 秒，或使用移液器吹打混勻，注意避免產生氣泡（此處也可直接使用細胞培養基清洗）。
（3）將流式管置于磁力架上 3 分鐘，棄上清。
（4）重復步驟 2-3，本次使用細胞培養基對磁珠再次清洗。共清洗磁珠兩次。
（5）使用細胞培養基重懸磁珠（比如：吸取 25 μL 磁珠進行清洗，25 μL 磁珠可用于 96 孔板的 10 個孔進行 T細胞激活實驗。清洗后用 1 mL 細胞培養基進行重懸，進行細胞激活時，每 100 μL 磁珠懸液加至 96 孔板的一個孔中）。

2、小鼠 T 細胞的激活：（以 96 孔板為例）
（1）調整 T 細胞濃度為 1 x 10⁷ cells/mL，每孔中加入 25 μL 細胞懸液，此時孔內含有 2.5 x 10⁵ 個 T 細胞，再向孔內添加 75 μL 細胞培養基，保持孔內總體積為 100 μL。
（2）向孔中加入 100 μL 清洗后重懸的磁珠，此時磁珠和細胞的數量比例為 1：1，孔內液體總體積為 200 μL。使用移液槍輕輕吹打混勻孔內的磁珠和細胞。
（3）將細胞培養板置于 37℃，5% CO2培養箱中培養，根據實驗需要決定細胞的培養時長。
（4）激活 24 小時至 48 小時內，收獲激活的 T 細胞，用于下游實驗分析。

3、小鼠 T 細胞的擴增：
（1）按照以上步驟激活 T 細胞，在加入磁珠的 48 小時檢測 T 細胞的激活情況。細胞狀態良好時，對細胞進行輕柔吹打、傳代（若細胞增殖較慢，可對細胞半量換液：小心吸棄 100 μL 上清液，再向孔內添加 100 μL 新鮮細胞培養基，輕柔吹打混勻細胞，繼續培養 1-2 天后傳代）。
（2）細胞與磁珠置于 37℃，5% CO2 培養箱中培養，根據實驗需要決定細胞的培養時長。
（3）每日或每隔兩日查看細胞擴增情況，小鼠 T 細胞擴增形態表現為鏡下可見的增殖聚團，正常情況下 T 細胞在激活后第 4-12 天表現出較快的增殖速度。當細胞皺縮或增殖速度明顯放慢時，提示細胞可能耗竭。
注意：在細胞激活的 48 小時內不要處理細胞。2 天后隨時觀察細胞狀態，當培養基變黃或孔內細胞數量過多時換液或傳代。（推薦定期進行細胞計數，當細胞密度超過 2.5x10⁶cells/mL 時，輕柔吹打混勻，將細胞密度調整為 0.5-1 x 10⁶cells/mL。）

今天講解就到這了，大家如有實驗問題，歡迎入群交流哦！

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